9种用于非靶向定量脂质组学研究的液相色谱-高分辨质谱平台间分析结果一致性的比较

        液相色谱-质谱联用法(LC-MS)是非靶向代谢组学和脂质组学研究最常用的分析技术。研究人员在使用不同厂家以及同一厂家不同型号的各种色谱高分辨质谱联用仪开展代谢组学研究时，经常会担心在不同的操作条件下，分析结果的差异可能会导致不同的生物学结论。为此，作者研究了9台不同的MS仪器间脂质组学数据的分析情况(包括1台TOF，1台Q/orbital ion trap和7台QTOF)。

        实验时7名健康受试者给予GLA脂肪餐或对照餐，分别在0，2和4h采集餐后的血浆样品用于分析。采用非空腹血浆混合样本以及NIST SRM 1950标准血浆样品作为QC样品。将300μl含有氘代脂质内标混合物的冷甲醇加入到40 μl血浆中，涡旋10 s。加入1000 μl含CE 22:1(提取内标)的冷MTBE，涡旋10 s，4℃振荡6 min。加入250 μl 水，以14000 rpm离心2 min。收集上层有机相，分为10份(每份100 μl)，吹干复溶后进行LC-MS分析，复溶体积视仪器而定。

        数据处理采用MS-DIAL 软件，脂质鉴定使用LipidBlast library公共数据库，通过匹配精确质量数和二级质谱数据，总共鉴定了 676对 tR–m/z 涵盖 11 个脂质大类。使用MetaboAnalyst进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。使用MetaBox、PubChem和Cytoscape进行代谢网络分析。

1 LC-MS系统的初步评估

        每台质谱仪的灵敏度和线性动态范围不同。为避免高丰度共洗脱脂质使离子源和检测器饱和，作者采用一个非空腹血浆提取物混合样品对仪器进行了初步评估。使用丰度最高的脂质PC (34:2)和TG (52:4)来确定每台仪器的最佳稀释倍数和进样体积，结果表明在脂质化合物线性相关性系数R²> 0.98时，9个LC-MS平台之间的定量分析结果非常相似。

2  LC-MS平台在大规模脂质组学研究中的比较

        LC-MS平台性能概述见表1。QC样品在各个LC-MS平台上鉴定到了209-307种脂质，153-293种脂质经内标校正的峰面积的RSD≤30%。为了测试9个LC-MS平台是否能正确评估经过饮食干预的7名受试者的生化特征，使用PLS-DA分析，脂质分布显示所有平台中对照组和GLA脂肪餐组均可显著分离。7名受试者在PLS-DA得分图上的位置表明个体脂质谱在LC-MS平台之间高度一致 (图1)。

表1 LC-MS平台性能评估概况

图1两组间(对照餐和GLA脂肪餐)的PLS-DA得分图

        使用PLS-DA分析结果， 将不同仪器平台VIP≥1的54种脂质建立脂质相关代谢网络，如图2所示，在所有平台中均找寻到的脂质占75%。所有仪器均发现含有18:3脂肪酸链的TG和DG在脂肪餐组显示出更高的浓度。最后，作者关注脂质定量结果在所有平台间的一致性，图3显示了两种组间差异较大的脂质TG(54:9)和TG(48:6)的定量结果，这两种甘油三酯在AGL脂肪餐后高度富集。TG(48:6)的平均值为0.8-1.6μM，TG(54:9)为0.9-3.1 μM。经过外标法计算得到的脂质浓度在所有平台间具有一致性。

图2饮食干预后脂质的代谢网络分析

图3  9台仪器通过外标法计算的脂质浓度（TG (54:9)和TG (48:6)）

3 LC-MS大规模脂质组学研究中定量数据的重现性

        作者采用TripleTOF 6600 LC–MS，一年后再次分析90个血浆样品，PLS-DA结果显示97%的样品是重合的(图4a)。此外，也得到了高度相似的脂质定量结果(图4b)。

图4 (a)间隔1年获得的饮食干预后样本的PLS-DA得分图；(b) 间隔1年获得的饮食干预后样本的脂质化合物浓度

参考文献：

CajkaT, Smilowitz JT, Fiehn O. Validating quantitative untargeted lipidomics across nine liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry platforms. [J] Anal Chem, 2017. doi: 10.1021/acs.analchem.7b03404.

文献整理人：任天坤；编辑：生宁  张金兰；第74期